Gleichmäßig aussäen mit dem richtigen Volumen
In der Zellkultur wird die Aussaatdichte meist als Zellzahl pro Quadratzentimeter Wachstumsfläche angegeben. So lassen sich Protokolle auf Gefäße unterschiedlicher Größe übertragen: Was in einer 6-Well-Platte funktioniert, gilt bei gleicher Dichte auch für eine Kulturflasche. Der Rechner übersetzt die Dichte in Zellen und Volumen pro Gefäß.
Grundlage ist die Zellkonzentration Ihrer Suspension nach dem Zählen. Daraus ergibt sich, wie viele Mikroliter Suspension in jedes Well gehören. Weil sehr kleine Volumina schwer genau zu pipettieren sind, empfiehlt sich ein Mastermix: Suspension und Medium werden für alle Gefäße gemeinsam angesetzt und dann gleichmäßig verteilt.
Der Rechner gibt dafür die Gesamtmenge an Zellsuspension und Medium aus, einschließlich eines Überschusses für Pipettierverluste. Die Zellkonzentration im Ansatz zeigt, wie viele Zellen pro Milliliter verteilt werden. Ist die Suspension zu verdünnt, um in das Arbeitsvolumen zu passen, weist der Rechner darauf hin.
Tipps für reproduzierbare Aussaaten
Die Flächen und Volumina der Gefäße im Auswahlmenü sind typische Werte gängiger Hersteller. Je nach Fabrikat weichen sie etwas ab, eine 6-Well-Platte kann etwa 9,0 bis 9,6 cm² haben. Für genaue Arbeiten wählen Sie „eigene Werte“ und tragen die Angaben aus dem Datenblatt Ihrer Platten ein; die Herstellerangaben haben Vorrang.
Mischen Sie die Zellsuspension vor dem Entnehmen gut, aber schonend, denn Zellen sedimentieren innerhalb weniger Minuten. Bewegen Sie die Platte nach dem Aussäen in Kreuzform vor und zurück statt zu kreisen, sonst sammeln sich die Zellen am Rand der Wells. Lassen Sie die Platte vor dem Brutschrank kurz bei Raumtemperatur stehen.
Für die Zellkonzentration zählen nur lebende Zellen. Bestimmen Sie die Vitalität mit Trypanblau und rechnen Sie mit der Lebendzellzahl. Den Weg von der Zählung in der Neubauer-Kammer zur Konzentration zeigt der Zählkammer-Rechner, bei Bakterienkulturen hilft der OD600-Rechner weiter.
Welche Dichte richtig ist, hängt von Zelllinie, Wachstumsgeschwindigkeit und Versuchsdauer ab. Viele adhärente Linien werden mit 10.000 bis 40.000 Zellen pro cm² ausgesät, für Transfektionen oft so, dass sie am nächsten Tag zu 70 bis 90 Prozent konfluent sind. Arbeiten Sie unter der Sicherheitswerkbank nach den Regeln der jeweiligen Schutzstufe.
Tipps und typische Fehler
Sauber aussäen.
- Mischen: Vor jeder Entnahme.
- Vitalität: Trypanblau.
- Verteilen: Kreuzförmig.
- Fläche: Laut Datenblatt.
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Häufige Fragen
Wie berechne ich das Volumen für die Zellaussaat?
Gewünschte Dichte mal Wachstumsfläche ergibt die Zellzahl pro Well, geteilt durch die Zellkonzentration das Volumen.
Wie viele Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte?
Bei 20.000 Zellen pro cm² und 0,32 cm² sind es 6.400 Zellen pro Well.
Warum einen Überschuss einplanen?
Beim Pipettieren bleiben Reste in Spitzen und Reservoir, ohne Überschuss reicht der Ansatz nicht für alle Wells.
Wie viele Zellen hat eine konfluente T75-Flasche?
Je nach Zelllinie grob 5 bis 15 Millionen.
Warum Zellen pro cm² statt pro Well angeben?
So lassen sich Protokolle auf Gefäße unterschiedlicher Größe übertragen.
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