Was das Lambert-Beer-Gesetz beschreibt
Wenn Licht durch eine gefärbte oder UV-absorbierende Lösung fällt, wird ein Teil davon geschluckt. Das Lambert-Beer-Gesetz verknüpft die Extinktion, also die logarithmische Abschwächung des Lichts, mit der Konzentration des absorbierenden Stoffes, der Weglänge durch die Probe und einer stoffspezifischen Konstante, dem molaren Extinktionskoeffizienten. Es ist die Grundlage fast jeder photometrischen Konzentrationsbestimmung.
Der Rechner löst die Gleichung wahlweise nach der Konzentration, der Extinktion oder dem Extinktionskoeffizienten auf. Damit lassen sich Enzymtests mit NADH, Proteinbestimmungen bei 280 nm oder Farbstoffkonzentrationen auswerten. Ebenso können Sie aus einer Probe bekannter Konzentration den Koeffizienten bestimmen und ihn danach für unbekannte Proben verwenden.
Zusätzlich gibt er die Transmission an. Sie ist der Anteil des Lichts, der die Probe durchdringt, und hängt über eine Zehnerpotenz mit der Extinktion zusammen. Eine Extinktion von 1 bedeutet, dass nur zehn Prozent des Lichts ankommen, bei 2 ist es ein Prozent. Die Konzentration wird in Mikromol und Millimol pro Liter ausgegeben.
E = ε × c × d; c = E ÷ (ε × d); ε = E ÷ (c × d); Transmission T = 10^−E
Grenzen der Methode
Das Gesetz gilt streng nur für verdünnte Lösungen, monochromatisches Licht und Stoffe, die sich in der Lösung nicht verändern. Bei hohen Konzentrationen treten Wechselwirkungen zwischen Molekülen auf, und der Zusammenhang wird nichtlinear. Viele Geräte arbeiten zuverlässig bis zu Extinktionen von etwa 1 bis 1,5; darüber sollte die Probe verdünnt werden. Der Rechner weist auf solche Werte hin.
Der Extinktionskoeffizient hängt von Wellenlänge, Lösungsmittel, pH-Wert und Temperatur ab. Übernehmen Sie Literaturwerte deshalb nur, wenn die Bedingungen vergleichbar sind, und prüfen Sie den Stand Ihrer Quelle. Für Proteine lässt sich der Koeffizient bei 280 nm aus dem Gehalt an Tryptophan, Tyrosin und Cystin abschätzen, etwa nach der Methode von Pace und Kollegen.
Achten Sie bei der Messung auf den Leerwert. Er wird mit derselben Küvette und demselben Lösungsmittel ohne den gesuchten Stoff aufgenommen und vom Messwert abgezogen. Trübungen, Luftblasen und Fingerabdrücke auf der Küvette streuen Licht und erhöhen die scheinbare Extinktion. Für Messungen im UV-Bereich unter etwa 320 nm sind Quarz- oder UV-taugliche Kunststoffküvetten nötig.
Für Nukleinsäuren gibt es eigene Umrechnungsfaktoren, die der DNA-Konzentration-Rechner verwendet. Wer die Energie der eingesetzten Strahlung wissen möchte, findet sie im Photonenenergie-Rechner. Aus der Konzentration in mol pro Liter lässt sich mit dem Molaritäts-Rechner die Masse für einen Ansatz bestimmen.
Tipps und typische Fehler
Photometrie sauber.
- Leerwert: Immer messen.
- Linear: E unter 1,5.
- Küvette: Sauber halten.
- ε: Bedingungen prüfen.
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Häufige Fragen
Welche Einheit hat der Extinktionskoeffizient?
Meist Liter pro Mol und Zentimeter, also l/(mol·cm).
Was ist der Unterschied zwischen Extinktion und Transmission?
Die Transmission ist der durchgelassene Lichtanteil, die Extinktion ihr negativer dekadischer Logarithmus.
Bis zu welcher Extinktion ist die Messung zuverlässig?
Je nach Gerät meist bis etwa 1 bis 1,5; darüber verdünnen.
Warum braucht man einen Leerwert?
Er zieht die Absorption von Lösungsmittel und Küvette ab.
Welche Küvette für UV-Messungen?
Unter etwa 320 nm Quarz- oder UV-taugliche Küvetten.
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