Wie viel DNA steckt in meiner Probe?
Nach einer Plasmid-Präparation, einer Genom-Extraktion oder einer RNA-Isolierung muss die Ausbeute bestimmt werden, bevor es weitergeht. Der Standardweg ist die UV-Photometrie: Nukleinsäuren absorbieren wegen ihrer Basen bei 260 Nanometern. Aus der Absorption lässt sich mit einem empirischen Faktor die Konzentration berechnen, ohne die Probe zu verbrauchen.
Eine Absorption von 1,0 bei einem Zentimeter Schichtdicke entspricht etwa 50 µg/ml doppelsträngiger DNA, 40 µg/ml RNA und 33 µg/ml einzelsträngiger DNA. Diese Werte finden sich in Standardwerken wie Sambrook und Russell, Molecular Cloning. Der Rechner multipliziert die gemessene A260 mit diesem Faktor und dem Verdünnungsfaktor und teilt durch die Schichtdicke.
Zusätzlich zeigt er das Verhältnis A260 zu A280. Proteine absorbieren wegen aromatischer Aminosäuren stärker bei 280 nm. Reine DNA liegt bei etwa 1,8, reine RNA bei etwa 2,0. Deutlich niedrigere Werte deuten auf Protein- oder Phenolreste hin. Aus Konzentration und Probenvolumen ergibt sich schließlich die Gesamtmenge in Mikrogramm.
Messfehler vermeiden
Photometer messen nur in einem begrenzten Bereich linear. Für A260 gilt als Faustregel ein Bereich von etwa 0,1 bis 1,0. Liegt der Wert darunter, wird das Rauschen groß; liegt er darüber, sollte die Probe stärker verdünnt werden. Der Rechner weist darauf hin, wenn die eingegebene Absorption außerhalb dieses Bereichs liegt.
Messen Sie gegen einen Leerwert im selben Puffer, in dem die Probe gelöst ist. Tris-EDTA oder Elutionspuffer aus Kits können selbst geringfügig absorbieren. Wasser mit niedrigem pH-Wert senkt das A260/A280-Verhältnis bei RNA, weshalb manche Labore in leicht basischem Puffer messen. Auch Luftblasen und Kratzer in der Küvette verfälschen das Ergebnis.
Ein zweiter Reinheitsindikator ist das Verhältnis A260 zu A230, das Salze, Guanidin oder Kohlenhydrate anzeigt; es sollte über 1,8 liegen. Das Photometer unterscheidet außerdem nicht zwischen DNA, RNA und freien Nukleotiden. Für genaue Mengen, etwa für Sequenzierung oder Bibliotheksbau, sind fluoreszenzbasierte Verfahren mit DNA-spezifischen Farbstoffen zuverlässiger.
Bei Oligonukleotiden ist der Faktor stark sequenzabhängig. Der hier angebotene Wert von 20 µg/ml ist nur eine grobe Näherung; genauer rechnen Sie mit dem Extinktionskoeffizienten des Herstellers im Lambert-Beer-Rechner. Für die Weiterverwendung in Ligation oder qPCR helfen der Ligations- und der Kopienzahl-Rechner.
Tipps und typische Fehler
Richtig messen.
- Leerwert: Gleicher Puffer.
- Bereich: A260 0,1 bis 1,0.
- Reinheit: Um 1,8 für DNA.
- Genauer: Fluoreszenz.
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Häufige Fragen
Welcher Faktor gilt für dsDNA, RNA und ssDNA?
Bei A260 = 1 etwa 50 µg/ml dsDNA, 40 µg/ml RNA und 33 µg/ml ssDNA.
Was bedeutet ein A260/A280-Wert von 1,6?
Er deutet auf Verunreinigungen mit Protein oder Phenol hin.
Muss ich die Schichtdicke ändern?
Nur wenn Ihr Gerät nicht auf 1 cm normiert; bei Küvetten mit 1 cm bleibt der Wert 1.
Was zeigt A260/A230?
Verunreinigungen durch Salze, Guanidin oder Kohlenhydrate; Zielwert über 1,8.
Welcher Messbereich ist zuverlässig?
A260 etwa zwischen 0,1 und 1,0.
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