Kopienzahl für qPCR und digitale PCR
Für eine absolute Quantifizierung in der qPCR braucht man eine Standardkurve aus Proben mit bekannter Kopienzahl. Meist dient dafür ein Plasmid oder ein PCR-Produkt, dessen Masse photometrisch bestimmt wurde. Der Rechner übersetzt diese Masse in die Zahl der Moleküle und hilft, die Ausgangslösung so zu verdünnen, dass die Standardreihe bei einer runden Kopienzahl beginnt.
Die Rechnung folgt direkt aus der Definition des Mols. Ein Molekül mit 5.000 Basenpaaren hat bei 650 Gramm pro Mol je Basenpaar eine molare Masse von 3.250.000 Gramm pro Mol. Ein Mol enthält nach der Avogadro-Konstante 6,022 × 10^23 Teilchen. Teilt man die Masse durch die molare Masse und multipliziert mit dieser Konstante, erhält man die Kopienzahl.
Zusätzlich zeigt der Rechner die Masse einer einzelnen Kopie in Attogramm. Das ist nützlich, um Genomäquivalente abzuschätzen: Ein haploides menschliches Genom wiegt rund 3,3 Pikogramm. Den Verdünnungsfaktor bis zur Zielkonzentration können Sie in mehrere Schritte aufteilen, etwa zuerst 1:100 und dann weitere Zehnerstufen.
Kopien = Masse (ng) × 10^−9 × 6,022 × 10^23 ÷ (Länge (bp) × 650 g/mol); Kopien pro µl = Kopien ÷ Volumen; Verdünnungsfaktor = Kopien pro µl ÷ Ziel
Genauigkeit und Praxis
Die Kopienzahl kann nur so genau sein wie die Massenbestimmung. Photometrische Messungen kleiner Konzentrationen sind unsicher; fluorometrische Verfahren mit DNA-spezifischen Farbstoffen liefern meist bessere Werte. Bei Plasmiden beeinflusst außerdem die Konformation die PCR-Effizienz: Superspiralisierte Plasmide werden oft schlechter amplifiziert als linearisierte, weshalb viele Protokolle eine Linearisierung empfehlen.
Der Wert von 650 Gramm pro Mol je Basenpaar ist ein gebräuchlicher Mittelwert für das Natriumsalz doppelsträngiger DNA. Manche Quellen verwenden 660 g/mol; der Unterschied liegt bei rund 1,5 Prozent. Für einzelsträngige DNA oder RNA tragen Sie etwa 330 beziehungsweise 340 g/mol je Base ein. Für exakte Werte lässt sich die molare Masse aus der Sequenz berechnen.
Sehr starke Verdünnungen sollten Sie schrittweise und mit frischen Pipettenspitzen ansetzen. Bei niedrigen Kopienzahlen im einstelligen oder zweistelligen Bereich je Reaktion schwanken die Ergebnisse statistisch nach der Poisson-Verteilung. Ein Träger wie tRNA oder ein Puffer mit geringer Bindung an Kunststoff verhindert, dass DNA an der Gefäßwand haften bleibt.
Für die Verdünnungsstufen der Standardkurve nutzen Sie den Verdünnungsreihe-Rechner, für die Bestimmung der Ausgangskonzentration den DNA-Konzentration-Rechner. Die Kopienzahl ist auch für Ligationen hilfreich, wenn Stoffmengen statt Massen gefragt sind; dafür eignet sich zusätzlich der Ligation-Rechner.
Tipps und typische Fehler
Standards ansetzen.
- Masse: Genau messen.
- Linear: Plasmid schneiden.
- Stufen: Zehnerreihe.
- Träger: Gegen Verluste.
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Häufige Fragen
Wie berechne ich Kopien aus ng?
Masse durch die molare Masse des Moleküls teilen und mit der Avogadro-Konstante multiplizieren.
Welche molare Masse je Basenpaar soll ich nehmen?
Für dsDNA meist 650 g/mol, manche Labore nutzen 660 g/mol.
Gilt der Rechner auch für RNA?
Ja, mit etwa 340 g/mol je Base statt des Basenpaar-Werts.
Wie viel wiegt ein menschliches Genom?
Ein haploides Genom etwa 3,3 Pikogramm.
Soll ich Plasmide für Standards linearisieren?
Viele Protokolle empfehlen es, weil superspiralisierte DNA schlechter amplifiziert wird.
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