Warum das molare Verhältnis zählt
Bei einer Ligation sollen Insert und Vektor in einem bestimmten Mengenverhältnis aufeinandertreffen. Entscheidend ist dabei nicht die Masse, sondern die Zahl der DNA-Enden, also die Stoffmenge. Ein Insert mit 1.000 Basenpaaren wiegt pro Molekül nur ein Drittel eines Vektors mit 3.000 Basenpaaren. Gleiche Nanogramm-Mengen würden daher dreimal so viele Insert- wie Vektormoleküle bedeuten.
Der Rechner überträgt das gewünschte molare Verhältnis in eine Masse. Dazu teilt er die Insertlänge durch die Vektorlänge, multipliziert mit der Vektormenge und dem Verhältnis. Das ist die Standardformel, wie sie Enzymhersteller in ihren Ligationsprotokollen angeben. Die Länge des Vektors ist dabei die Länge nach dem Schneiden, ohne herausgeschnittenes Fragment.
Zusätzlich rechnet er die Stoffmengen von Vektor und Insert in Femtomol aus, mit einer mittleren molaren Masse von 650 Gramm pro Mol je Basenpaar. Viele Protokolle nennen Zielmengen in fmol, etwa 20 bis 100 fmol Vektor pro Ansatz. Aus der Konzentration Ihrer Insert-Lösung ergibt sich direkt das Pipettiervolumen.
Verhältnis und Ansatz richtig wählen
Für klassische Klonierungen mit klebrigen Enden ist ein Verhältnis von 3:1 ein bewährter Ausgangspunkt. Sehr kleine Inserts, etwa annealte Oligonukleotide oder Fragmente unter 200 Basenpaaren, werden oft mit 5:1 bis 10:1 eingesetzt. Bei großen Inserts, die fast so lang wie der Vektor sind, reicht häufig 1:1. Wer unsicher ist, setzt mehrere Ansätze parallel an.
Ein zu hoher Insert-Anteil kann dazu führen, dass mehrere Inserts hintereinander eingebaut werden, besonders bei nicht gerichteter Klonierung. Ein zu niedriger Anteil erhöht dagegen den Anteil religierter Leervektoren. Eine Kontrolle nur mit Vektor ohne Insert zeigt, wie hoch der Hintergrund ist. Dephosphorylierte Vektoren senken die Selbstligation deutlich.
Achten Sie darauf, dass die Konzentrationsangaben stimmen. Nach einer Gelextraktion ist die Photometrie oft ungenau, weil Rückstände aus dem Kit stören. Eine Abschätzung über die Bandenintensität im Gel im Vergleich zum Größenmarker kann hier zuverlässiger sein. Das Gesamtvolumen des Ansatzes sollte zum Puffer passen; üblich sind 10 bis 20 µl.
Für Gibson- oder ähnliche Assembly-Verfahren gelten oft eigene Empfehlungen in pmol je Fragment. Auch dafür liefern die fmol-Angaben des Rechners eine Grundlage. Die Konzentration Ihrer DNA bestimmen Sie mit dem DNA-Konzentration-Rechner, die passende Gelstärke zur Kontrolle der Fragmente mit dem Agarosegel-Rechner.
Tipps und typische Fehler
Ligation ansetzen.
- Start: 3:1.
- Kleines Insert: Mehr nehmen.
- Kontrolle: Nur Vektor.
- Volumen: 10 bis 20 µl.
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Häufige Fragen
Welches molare Verhältnis ist bei der Ligation üblich?
Meist 3:1 Insert zu Vektor; bei kleinen Inserts mehr, bei großen weniger.
Welche Vektorlänge muss ich eingeben?
Die Länge des geschnittenen Vektors, ohne das herausgeschnittene Stück.
Warum 650 g/mol je Basenpaar?
Das ist der übliche Mittelwert für ein Basenpaar doppelsträngiger DNA als Natriumsalz.
Wie viel Vektor nehme ich pro Ligation?
Häufig 20 bis 100 ng, je nach Protokoll und Vektorgröße.
Warum eine Kontrolle ohne Insert?
Sie zeigt den Hintergrund durch religierte Leervektoren.
- Ligation Rechner
- Insert Menge berechnen
- Ligation Verhältnis 3:1
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- Ligation ng berechnen
- Klonierung Insert Menge
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