Rechnerwerk
Chemie & Biologie

PCR-Mastermix berechnen

Geben Sie die Zahl der Reaktionen, das Reaktionsvolumen und die Stamm- und Endkonzentrationen Ihrer Komponenten ein. Der Rechner liefert ein Pipettierschema für den gesamten Mix.

Ihr Ansatz
Proben plus Positiv- und Negativkontrolle.
Ausgleich für Pipettierverluste, üblich 5 bis 10 %.
Wird nicht in den Mix gegeben, sondern einzeln zugesetzt.
0, wenn der Puffer bereits Magnesium enthält.
Ergebnis

Ein Mastermix spart Zeit und Fehler

Bei der Polymerase-Kettenreaktion werden in jedem Ansatz dieselben Komponenten benötigt: Reaktionspuffer, Desoxynukleotide, zwei Primer, oft zusätzliches Magnesium, die Polymerase und Wasser. Statt jede Komponente in jedes Röhrchen einzeln zu pipettieren, setzt man einen Mastermix für alle Reaktionen an und verteilt ihn. Das spart Pipettierschritte und sorgt für identische Bedingungen in allen Proben.

Für jede Komponente gilt die Verdünnungsformel C1 · V1 = C2 · V2. Bei 50 µl Reaktionsvolumen und zehnfach konzentriertem Puffer sind das 5 µl, bei 10 mM dNTPs und 0,2 mM Endkonzentration 1 µl. Die Polymerase wird in Einheiten dosiert: 1,25 U aus einer Stammlösung mit 5 U/µl ergeben 0,25 µl. Wasser füllt auf das Reaktionsvolumen abzüglich Template auf.

Der Rechner multipliziert alle Volumen mit der Zahl der Reaktionen und einem Pipettierzuschlag. Ohne Zuschlag fehlt am Ende oft Mix für das letzte Röhrchen, weil an Pipettenspitzen und Gefäßwänden Flüssigkeit hängen bleibt.

V (Komponente)=Reaktionsvolumen⋅EndkonzentrationStammkonzentration; V (Polymerase)=Uje ReaktionU / µ l; V (Mix)=(Reaktionsvolumen−Template)⋅n⋅(1+Zuschlag)V\,\left(\text{Komponente}\right) = \frac{\text{Reaktionsvolumen} \cdot \text{Endkonzentration}}{\text{Stammkonzentration}};\ V\,\left(\text{Polymerase}\right) = U\quad \text{je}\ \frac{\text{Reaktion}}{U\,/\,µ\,l};\ V\,\left(\text{Mix}\right) = \left(\text{Reaktionsvolumen} - \text{Template}\right) \cdot n \cdot \left(1 + \text{Zuschlag}\right)

Beispiel: Zehn Reaktionen à 50 µl mit 10 % Zuschlag ergeben 11 Ansätze. Je Reaktion: 5 µl 10× Puffer, 1 µl dNTPs (10 → 0,2 mM), je 1 µl Forward- und Reverse-Primer (10 → 0,2 µM), 0,25 µl Polymerase (1,25 U bei 5 U/µl), 2 µl Template separat, Wasser 50 − 2 − 8,25 = 39,75 µl. Mix gesamt 48 µl · 11 = 528 µl: 437,25 µl Wasser, 55 µl Puffer, 11 µl dNTPs, je 11 µl Primer und 2,75 µl Polymerase. Je Röhrchen 48 µl vorlegen und 2 µl Template zugeben.

Pipettierpraxis und typische Konzentrationen

Die Standardwerte entsprechen gängigen Protokollen für Taq-Polymerase: 1× Puffer, 200 µM je dNTP, 0,1 bis 0,5 µM je Primer und 1 bis 2,5 Einheiten Polymerase pro 50 µl. Hochpräzise Polymerasen, Hot-Start-Enzyme oder fertige Mastermixe haben eigene Vorgaben. Maßgeblich sind immer die Angaben im Datenblatt des Herstellers.

Magnesium ist der wichtigste Stellhebel für Spezifität und Ausbeute. Viele Puffer enthalten bereits 1,5 mM MgCl₂; dann tragen Sie für die zusätzliche Konzentration 0 ein. Bei magnesiumfreiem Puffer oder zur Optimierung ergänzen Sie gezielt, etwa in Schritten von 0,5 mM. Zu viel Magnesium fördert unspezifische Produkte, zu wenig senkt die Ausbeute.

Pipettieren Sie in einer sinnvollen Reihenfolge: zuerst Wasser, dann Puffer, dNTPs und Primer, die Polymerase zuletzt und auf Eis. Mischen Sie den Mix vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren oder kurzes Vortexen ohne Enzym und zentrifugieren Sie kurz ab. Arbeiten Sie mit Filterspitzen und in einem getrennten Bereich, um Kontaminationen mit amplifizierter DNA zu vermeiden.

Planen Sie immer eine Negativkontrolle ohne Template ein, bei der Sie Wasser statt DNA zugeben. Sie zeigt, ob Reagenzien kontaminiert sind. Eine Positivkontrolle mit bekanntem Template bestätigt, dass Reaktion und Programm funktionieren. Beide zählen bei der Zahl der Reaktionen mit.

Tipps und typische Fehler

Sauber pipettieren.

  • Zuschlag: 5 bis 10 %.
  • Enzym: Zuletzt.
  • Kontrollen: Mitzählen.
  • Datenblatt: Geht vor.

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Häufige Fragen

Wie viel Puffer brauche ich für 50 µl PCR?

Bei 10× Puffer 5 µl je Reaktion für 1× Endkonzentration.

Warum einen Pipettierzuschlag einplanen?

Pipettierverluste würden sonst dazu führen, dass für die letzte Reaktion Mix fehlt.

Gehört das Template in den Mastermix?

Nein, das Template wird jeder Reaktion einzeln zugegeben.

Wie viel Primer kommt in eine PCR?

Meist 0,1 bis 0,5 µM je Primer in der Endkonzentration.

Wann wird die Polymerase zugegeben?

Zuletzt und auf Eis, um unspezifische Aktivität zu vermeiden.

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