Wann ein Protein ungeladen ist
Peptide und Proteine tragen saure und basische Gruppen: den N-Terminus, den C-Terminus und die Seitenketten von Aspartat, Glutamat, Lysin, Arginin, Histidin, Cystein und Tyrosin. Je nach pH-Wert geben diese Gruppen Protonen ab oder nehmen sie auf. Die Summe aller Teilladungen ist die Nettoladung des Moleküls.
Der isoelektrische Punkt, kurz pI, ist der pH-Wert, bei dem sich positive und negative Ladungen genau ausgleichen. Dort wandert das Protein im elektrischen Feld nicht, und seine Löslichkeit ist oft am geringsten. Der Rechner zählt die ionisierbaren Reste und sucht den pI numerisch über die Henderson-Hasselbalch-Gleichung.
Weil die pKs-Werte einzelner Gruppen im Protein von ihrer Umgebung abhängen, gibt es verschiedene Tabellen. Zur Wahl stehen die Werte des Programmpakets EMBOSS, die Lehrbuchwerte freier Aminosäuren nach Lehninger und der Satz nach Solomon. Die Unterschiede zeigen, wie unsicher eine reine Sequenzrechnung ist.
Wofür der pI gebraucht wird
Der isoelektrische Punkt ist im Labor eine wichtige Planungsgröße. Für die Ionenaustauschchromatographie wählt man den Puffer-pH so, dass das Zielprotein geladen ist und bindet: unterhalb des pI an einen Kationenaustauscher, oberhalb an einen Anionenaustauscher. Ein Abstand von etwa einer pH-Einheit gilt als Faustregel.
Auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der zweidimensionalen Gelelektrophorese trennt man Proteine nach ihrem pI. Bei der Reinigung lässt sich die geringe Löslichkeit am pI für eine Fällung nutzen. Umgekehrt sollte man Lagerpuffer nicht genau auf den pI einstellen, wenn das Protein in Lösung bleiben soll.
Die Rechnung berücksichtigt keine posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung, keine Disulfidbrücken, bei denen Cysteine nicht mehr titrierbar sind, und keine Effekte der Faltung. Bei stark verborgenen oder benachbarten geladenen Gruppen weichen echte pKs-Werte deutlich ab. Gemessene pI-Werte können daher um mehrere Zehntel abweichen.
Für Peptide mit geschützten Termini, etwa acetyliertem N-Terminus oder amidiertem C-Terminus, ist das Ergebnis zu korrigieren, da diese Gruppen dann keine Ladung tragen. Die molare Masse der Sequenz berechnet der Peptid-Molmasse-Rechner. Für Forschungsergebnisse sollten Sie den pI experimentell bestätigen.
Tipps und typische Fehler
Proteine trennen.
- Puffer: Abstand zum pI.
- Termini: Schutzgruppen beachten.
- Cysteine: Disulfide prüfen.
- Messung: pI bestätigen.
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Häufige Fragen
Was ist der isoelektrische Punkt?
Der pH-Wert, bei dem ein Molekül nach außen ungeladen ist, weil sich positive und negative Ladungen ausgleichen.
Warum liefern verschiedene Programme unterschiedliche pI-Werte?
Sie verwenden unterschiedliche pKs-Tabellen für die ionisierbaren Gruppen.
Welche Aminosäuren bestimmen den pI?
Vor allem D, E, K, R und H sowie die beiden Termini; C und Y wirken bei höherem pH.
Welcher Puffer-pH für die Ionenaustauschchromatographie?
Etwa eine Einheit unter dem pI für Kationen- und eine Einheit darüber für Anionenaustauscher.
Ist ein Protein am pI schlecht löslich?
Oft ja, weil die abstoßende Ladung fehlt; das nutzt man bei der isoelektrischen Fällung.
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